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IHC全攻略4:一抗的选择与优化

时间:2017-10-11 15:01:43

在设计IHC/ICC实验时,一抗的选择是相当重要的。IHC/ICC实验的所有步骤都必须经过优化,以便观察到特异染色,并尽可能减少非特异的背景染色。这包括开展预实验,以确定每个一抗的适当孵育条件。抗原亲和纯化的多克隆抗体的稀释度通常低于单克隆抗体,但这些值必须根据经验确定。为了获得可靠特异的信号,应采用交叉反应性极少的高质量抗体。

一抗孵育的起始条件


单克隆抗体

多克隆抗体

组织

5-25 µg/mL4 °C孵育过夜

1.7-15 µg/mL4 °C孵育过夜

细胞

5-25 µg/mL,室温下1小时

1.7-15 µg/mL,室温下1小时

优势

单表位特异性

所需浓度较低

限制

易受表位遮蔽的影响

异质群体

选择单克隆还是多克隆抗

单克隆和多克隆抗体的内在特征决定了它们用于IHC/ICC时的优势和限制。单克隆抗体由单个B细胞克隆产生,代表了同质群体,能够高亲和力高特异性地与单个表位结合。这在检测蛋白家族的某个成员时特别有用,因为蛋白家族有着高比例的氨基酸同源性。

抗体结合往往依赖于目标蛋白维持其天然的构想状态。与其他蛋白的相互作用、翻译后修饰、温度、pH、固定和盐浓度都会影响抗体接近目的表位。多克隆抗体是异质的,可识别多个表位,因此它们较少受到蛋白构象变化的影响。一般而言,多克隆抗体在一定pH和盐浓度范围内也比单克隆抗体更为稳定。基于这些原因,多克隆抗体更常用于IHC/ICC实验。

多克隆抗体的亲和纯化

多克隆抗血清是抗体混合物,它们由大量B细胞克隆产生。组成多克隆抗血清的抗体以不同的特异性和亲和力与目标表位结合,也与不相关的目标分子交叉反应(非特异相互作用)。为了富集与目的抗原特异性和亲和力最高的抗体,R&D Systems的多克隆抗体经过抗原亲和纯化。在此过程中,多克隆抗血清流过包含固定化抗原分子的亲和柱。特异抗体被固定化抗原保留,而非特异抗体流过柱子,被丢弃。随后从柱子上洗脱经抗原亲和纯化的抗体。抗原亲和纯化的抗体主要与目的抗原相互作用,降低了背景染色,与未纯化抗体相比产生了更一致的结果。

一抗孵育的优化

一抗浓度、稀释液、孵育时间和温度都影响了染色质量。这些变量需要针对每个抗体和样品来优化,以便实现特异染色和低背景。优化通常是保持孵育时间和温度不变,而改变抗体浓度,以确定何时获得最佳信号和低背景噪音。例如,如果使用高亲和力的抗体,那么相对较高的浓度可能需要较短的孵育时间。相反,较低的抗体浓度可能需要较长的孵育时间。人们通常采用较长的孵育时间,以确保抗体完全渗透到体视学技术所用的组织切片。为了促进特异染色,较长时间的孵育通常在低温下开展(即4 °C vs 室温)。

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