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IHC全攻略7:预防非特异性染色

时间:2017-10-11 15:34:35

所有IHC/ICC研究都依赖特异的抗体-抗原表位结合,这是由疏水相互作用、氢键及其它分子间作用力来控制的。不过,相同的吸引力也可能引起非特异染色,即一抗与目的抗原表位之外的氨基酸结合。这是IHC/ICC实验中经常存在的一个问题。我们的挑战在于如何降低非特异相互作用,而不损害抗体-表位的结合。

非特异染色的原因包括一抗和二抗与血清蛋白的相互作用,抗体与组织之间的离子相互作用,以及与能够影响IHC检测系统的内源分子的相互作用。这些问题会产生高背景,以及无法在适当的细胞位置观察目的抗原。这种类型的染色问题可通过用封闭剂来封闭非特异相互作用来解决。在将样本与一抗共同孵育之前,可开展这些步骤。

预防非特异疏水相互作用

尽管疏水相互作用在抗原表位-抗体的结合中起了重要作用,但这些力同样能促进非特异结合。由于一些氨基酸的中性侧链,大部分蛋白有着某种程度的疏水性。将组织与热灭活的正常血清或牛血清白蛋白(BSA)共同孵育,是降低非特异疏水结合的常用步骤。正常血清类型的选择对预防与一抗或二抗的相互作用,或预防与待染色组织/细胞的相互作用很重要。例如,在使用山羊来源的一抗时,不建议用山羊血清作为封闭剂。而是推荐与二抗的宿主动物相同的血清或来自不相关物种的血清。BSA和脱脂奶粉常用作封闭剂。这些试剂通常包含在一抗和二抗的稀释液中。非离子去污剂如0.3% Triton X-100™或Tween 20™的添加也能降低非特异疏水相互作用。

预防非特异离子相互作用

如果使用的抗体与目的组织有着相反的净电荷,那么离子相互作用可能导致非特异的背景染色。例如,非特异染色可能来自相反的羧基和氨基相互作用。范德华力、两级分子间的弱静电相互作用也能起作用。增加固定剂和/或抗体稀释液的离子强度能降低离子相互作用。不过,表位-抗体结合通常依赖于离子强度,因此这种方法也可能负面影响染色特异性。由于单克隆抗体的单表位特异性,与多克隆抗体相比,增加离子强度更可能损害其性能。

内源酶的干扰

显色检测法常使用一种结合的酶来观察表位-抗体的相互作用。在使用这种检测方法时,同一种酶的内源活性必须被封闭。例如,包含辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)的操作步骤可能需要试剂来防止非特异信号。肾、肝或带有红细胞的血管区域等组织含有内源的过氧化物酶活性。由3-10% H2O2配制而成的过氧化物酶封闭液能用于防止内源的过氧化物酶切割底物。内源的碱性磷酸酶主要在肠、肾、淋巴及其它组织中发现,能被1 mM 左旋咪唑(Levamisole)封闭。碱性磷酸酶的肠道形式不受左旋咪唑影响,但能用1% 乙酸封闭。

内源的生物素干扰

链亲和素与生物素化的一抗或二抗结合,是IHC/ICC实验常用的另一种检测系统。因此,在链亲和素孵育之前,内源的生物素必须被封闭。内源的生物素在多个组织中发现,包括肝、肾、心脏、脑和肺。样本与亲和素(avidin)预先孵育,通常可封闭内源的生物素。接下来必须与生物素共同孵育,以封闭亲和素分子上多余的生物素结合位点。在这些生物素/亲和素封闭步骤之后,样本才能与一抗孵育。

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